β-地中海貧血是一種常染色體隱性遺傳病，我國南方這種遺傳病的常見病因 是血紅蛋白 β 珠蛋白基因（HBB）編碼區(qū) 4 個(gè)堿基（3'-CTTT-5'）缺失。下圖 1 是一種基因治療 β-地中海貧血的技術(shù)路線，圖 2 是圖 1 過程③外源 DNA 導(dǎo)入 iPS 細(xì)胞 （誘導(dǎo)多能干細(xì)胞） 后，在細(xì)胞內(nèi)利用 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)和外源單鏈 DNA 及 DNA 自我修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行基因治療的主要過程。請(qǐng)據(jù)圖回答問題。

（1）利用患者的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成 iPS 細(xì)胞，不僅可以避免在進(jìn)行細(xì)胞移植時(shí)發(fā)生 

免疫排斥

免疫排斥

，還因?yàn)?nbsp;iPS 細(xì)胞能

在體外培養(yǎng)時(shí)不斷增殖，并可誘導(dǎo)分化形成造血干細(xì)胞

在體外培養(yǎng)時(shí)不斷增殖，并可誘導(dǎo)分化形成造血干細(xì)胞

，可獲得足夠多的回輸細(xì)胞。
（2）根據(jù)圖 2 分析，在利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)進(jìn)行基因修復(fù)時(shí)，需要根據(jù)

HBB堿基缺失部位兩側(cè)的核苷酸序列

HBB堿基缺失部位兩側(cè)的核苷酸序列

 設(shè) 計(jì) 2 種 gRNA；導(dǎo)入單鏈 DNA 作為修復(fù)模板的目的是

正確修復(fù)基因（能獲得在指定部位插入缺失堿基CTTT的正常HBB基因）

正確修復(fù)基因（能獲得在指定部位插入缺失堿基CTTT的正常HBB基因）

。
（3）圖 1 的過程③中，研究人員將 gRNA 基因與Cas9 基因分別整合到不同的載體中，這是 因?yàn)檎系酵惠d體中會(huì)

使重組DNA分子過大

使重組DNA分子過大

，不容易導(dǎo)入細(xì)胞。研究人員將 gRNA 載體、Cas9 載體 和單鏈 DNA 按一定比例與 iPS 細(xì)胞混和后，對(duì)混合液進(jìn)行瞬時(shí)高壓電激處理，其目的 是

使重組載體和單鏈DNA更易導(dǎo)入iPS細(xì)胞

使重組載體和單鏈DNA更易導(dǎo)入iPS細(xì)胞

。
（4）導(dǎo)入 iPS 細(xì)胞的 gRNA 基因和 Cas9 基因需要利用細(xì)胞中的

RNA聚合酶

RNA聚合酶

 催化合成 gRNA 和 Cas9 mRNA，后者指導(dǎo)合成 Cas9 蛋白，并組裝成CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。圖 2 中酶 B 的功能是 

催化游離脫氧核苷酸連接到核苷酸鏈上（催化以導(dǎo)入的單鏈DNA為模板的核苷酸鏈的延伸）

催化游離脫氧核苷酸連接到核苷酸鏈上（催化以導(dǎo)入的單鏈DNA為模板的核苷酸鏈的延伸）

。
（5）為檢測 iPS 細(xì)胞中 HBB 基因是否正確修復(fù)，研究人員設(shè)計(jì)特異引物時(shí)，最好將插入片 段（CTTT）或互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)在引物的

3'

3'

 端。在 PCR 時(shí)可

適當(dāng)提高退火溫度

適當(dāng)提高退火溫度

，以提高引物結(jié)合 的特異性。