3.PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因,研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因),大小為0.9kb(1kb=1000堿基對),利用大腸桿菌表達該蛋白。請回答下列問題:
相關(guān)限制酶的識別序列及切割位點(注:箭頭表示切割位點)
名稱 |
識別序列及切割位點 |
名稱 |
識別序列及切割位點 |
HindⅢ |
A↓AGCTT TTCGA↑A |
EcoRⅠ |
G↓AATTC CTTAA↑G |
PvitⅡ |
CAG↓CTG GTC↑GAC |
PstⅠ |
CTGC↓AG GA↑CGTC |
KpnⅠ |
G↓GTACC CCATG↑G |
BamHⅠ |
G↓GATCC CCTAG↑G |
(1)為獲取phb2基因,提取該動物肝臟組織的總RNA經(jīng)RT-PCR獲得大量的目的基因,該過程使用到的酶有
。
(2)圖1為所用載體圖譜示意圖,圖中限制酶的識別序列及切割位點見表。為使phb2基因(該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列)與載體正確連接,在擴增的phb2基因兩端需添加
和
兩種限制酶的識別序列。雙酶切避免了目的基因與載體的
連接,同時減少目的基因與目的基因、載體與載體的連接,以提高重組質(zhì)粒的比例。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時,需使用的酶是
。
(3)轉(zhuǎn)化前需用CaCl
2處理大腸桿菌細(xì)胞,使其處于
態(tài)的生理狀態(tài),以提高轉(zhuǎn)化效率。
(4)將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),隨機挑取菌落(分別編號為1、2、3、4)培養(yǎng)并提取質(zhì)粒,用(2)中選用的兩種限制酶進行酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離,結(jié)果如圖2,
號菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。
(5)將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中,培養(yǎng)24小時后,檢測處于細(xì)胞周期(圖3)不同時期的細(xì)胞數(shù)量,統(tǒng)計結(jié)果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖可能的原因是:將細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的
(填“G
1”或“S”或“G
2/M”)期。