甜柿鮮果肉中含有可溶性糖、微量元素、維生素和β-胡蘿卜素等多種成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。甜柿的自然脫澀與乙醛代謝關(guān)鍵酶基因（PDC）密切相關(guān)，推測(cè)澀味程度可能與PDC基因的表達(dá)情況有關(guān)。為篩選PDC基因的調(diào)控蛋白，科研人員進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)?；卮鹣铝袉?wèn)題。

（1）啟動(dòng)子位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，同時(shí)啟動(dòng)子區(qū)域存在著許多調(diào)控蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，RNA聚合酶和調(diào)控蛋白共同影響了基因的

轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄

水平。
（2）PDC基因的啟動(dòng)子序列未知，為獲得大量該基因啟動(dòng)子所在片段，可利用限制酶將基因組DNA進(jìn)行酶切，然后在

DNA連接酶

DNA連接酶

的作用下將已知序列信息的接頭片段連接在PDC基因的上游，根據(jù)接頭片段和PDC基因編碼序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行

PCR

PCR

擴(kuò)增，在擴(kuò)增過(guò)程中使用的酶稱為

Taq酶

Taq酶

，在該酶的作用下可以將4種脫氧核苷酸加到引物的一端。
（3）AD基因表達(dá)出的AD蛋白與啟動(dòng)子足夠靠近時(shí)，能夠激活后續(xù)基因轉(zhuǎn)錄，據(jù)此可利用與AD蛋白形成的融合蛋白來(lái)篩選待測(cè)蛋白。利用質(zhì)粒A構(gòu)建含有PDC基因啟動(dòng)子片段的重組質(zhì)粒并導(dǎo)入代謝缺陷型酵母菌，用不含

尿嘧啶

尿嘧啶

的培養(yǎng)基可篩選出成功轉(zhuǎn)化的酵母菌Y1H；將從甜柿中提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄形成的各種cDNA與質(zhì)粒G連接后導(dǎo)入酵母菌，此時(shí)應(yīng)選擇質(zhì)粒G中的位點(diǎn)

2

2

（填序號(hào)1～5）作為cDNA的插入位點(diǎn)，最終獲得攜帶不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
（4）重組酵母Y1H與Y187能夠進(jìn)行接合生殖，形成的接合子含有兩種酵母菌質(zhì)粒上的所有基因。若接合子能在含有

金擔(dān)子素

金擔(dān)子素

的培養(yǎng)基中生存，則推測(cè)待測(cè)蛋白是PDC基因的調(diào)控蛋白。