In-Fusion技術(shù)是一項(xiàng)新型的無縫克隆技術(shù)。該技術(shù)關(guān)鍵是要在目的基因兩端構(gòu)建與線性化質(zhì)粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常為15-20bp），然后用In-Fusion酶處理即可實(shí)現(xiàn)無縫連接。它的操作步驟大致為：①利用PCR技術(shù)將質(zhì)粒線性化；
②PCR擴(kuò)增出兩端含線性化質(zhì)粒同源序列的目的基因；
③目的基因與線性化質(zhì)粒同源區(qū)域在In-Fusion酶作用下形成重組質(zhì)粒；
④將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。
回答下列問題。

（1）過程①需要用到的酶是

耐高溫的DNA聚合酶

耐高溫的DNA聚合酶

。過程③中，同源序列1與同源序列2中的堿基序列不同，這樣設(shè)計(jì)的好處是

防止目的基因反向連接，防止線性化質(zhì)?；蚰康幕蜃陨憝h(huán)化

防止目的基因反向連接，防止線性化質(zhì)粒或目的基因自身環(huán)化

。
（2）為保證擴(kuò)增出兩端含線性化質(zhì)粒同源序列的目的基因，引物A或引物B要依據(jù)

目的基因與質(zhì)粒

目的基因與質(zhì)粒

序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。
（3）若目的基因是氨芐青霉素抗性基因，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞。為檢測(cè)已轉(zhuǎn)化大腸桿菌的抗性效果，在含有氨芐青霉素和不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上分別接種等量的已轉(zhuǎn)化大腸桿菌并培養(yǎng)相同時(shí)間，然后采用

稀釋涂布平板

稀釋涂布平板

法進(jìn)行計(jì)數(shù)，若結(jié)果較真實(shí)值偏小，原因是

當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，在平板上觀察到的是一個(gè)菌落

當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，在平板上觀察到的是一個(gè)菌落

。
（4）與傳統(tǒng)構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法相比，In-Fusion技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有

不受限制酶酶切位點(diǎn)的限制；可以把目的基因插入任何位點(diǎn)；避免限制酶切割對(duì)質(zhì)粒功能區(qū)的破壞

不受限制酶酶切位點(diǎn)的限制；可以把目的基因插入任何位點(diǎn)；避免限制酶切割對(duì)質(zhì)粒功能區(qū)的破壞

。（至少答出兩點(diǎn)）