目前基因工程所用的質(zhì)粒載體主要是以天然細菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)重新組建的人工質(zhì)粒,pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體,其主要結(jié)構(gòu)如圖所示。
(1)構(gòu)建人工質(zhì)粒時要有抗性基因,以便于
篩選(鑒別)目的基因是否導(dǎo)入受體細胞
篩選(鑒別)目的基因是否導(dǎo)入受體細胞
。
(2)pBR322分子中有單個EcoRⅠ限制酶作用位點,EcoRⅠ只能識別序列—GAATTC—,并只能在G和A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個EcoRⅠ的切點,請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端:
。
(3)pBR322分子中另有單個的BamHⅠ限制酶作用位點,現(xiàn)將經(jīng)BamHⅠ處理后的質(zhì)粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因,通過DNA連接酶作用恢復(fù)
磷酸二酯
磷酸二酯
鍵,成功獲得了重組質(zhì)粒的原因是
兩種限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同
兩種限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同
。
(4)為了檢測上述重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入原本無Amp
r和Tet
r的大腸桿菌,將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),得到如圖二的菌落。再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上,使絨布面沾上菌落,然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),得到如圖三的結(jié)果(空圈表示與圖二對照無菌落的位置)。與圖三空圈相對應(yīng)的圖二中的菌落表現(xiàn)型是
能抗氨芐青霉素,但不能抗四環(huán)素
能抗氨芐青霉素,但不能抗四環(huán)素
,圖三結(jié)果顯示,多數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是
pBR322質(zhì)粒
pBR322質(zhì)粒
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