某小組為研究真菌基因m的功能,構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白M和tag標(biāo)簽的質(zhì)粒,請(qǐng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程回答下列問題:
(1)目的基因的擴(kuò)增:
①提取真菌細(xì)胞
RNA
RNA
,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,進(jìn)一步獲得基因m片段。
②為了獲得融合tag標(biāo)簽的蛋白M,設(shè)計(jì)引物P2時(shí),不能包含基因m終止密碼子的編碼序列,否則將導(dǎo)致
蛋白M上不含tag標(biāo)簽
蛋白M上不含tag標(biāo)簽
。
③熱啟動(dòng)PCR可提高擴(kuò)增效率,方法之一是:先將除TaqDNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后,加熱到80℃以上再混入酶,然后直接從94℃開始PCR擴(kuò)增,下列敘述正確的有
BC
BC
。
A.Taq酶最適催化溫度范圍為50~60℃
B.與常規(guī)PCR相比,熱啟動(dòng)PCR可減少反應(yīng)起始時(shí)引物錯(cuò)配形成的產(chǎn)物
C.兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸
D.PCR產(chǎn)物DNA堿基序列的特異性體現(xiàn)了Taq酶的特異性
(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建:
①將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合,用特定DNA酶處理形成黏性末端,然后降溫以促進(jìn)
黏性末端堿基配對(duì)
黏性末端堿基配對(duì)
,形成A-m結(jié)合體。將A-m結(jié)合體導(dǎo)入大腸桿菌,利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及
DNA連接
DNA連接
酶等,完成質(zhì)粒的環(huán)化。
②若正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A-m仍能被SmaⅠ切開,則SmaⅠ的酶切位點(diǎn)可能在
基因m的連接處、基因m的內(nèi)部
基因m的連接處、基因m的內(nèi)部
。
(3)融合蛋白的表達(dá):
①用含有尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)URA3基因缺失型酵母,將其作為受體菌,導(dǎo)入質(zhì)粒A-m,然后涂布于無尿嘧啶的培養(yǎng)基上,篩選獲得目的菌株,其機(jī)理是
受體菌在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng),導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌含有URA3基因可以長(zhǎng)成菌落
受體菌在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng),導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌含有URA3基因可以長(zhǎng)成菌落
。
②若通過抗原—抗體雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到酵母蛋白中含tag標(biāo)簽,說明
融合基因表達(dá)(或融合基因正確解碼)
融合基因表達(dá)(或融合基因正確解碼)
,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可借助tag標(biāo)簽進(jìn)行蛋白M的分離純化。