1965年中國(guó)科學(xué)家人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，摘取了人工合成蛋白質(zhì)的桂冠，如圖是利用基因工程生產(chǎn)人胰島素過(guò)程中使用的質(zhì)粒及目的基因的部分結(jié)構(gòu)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。
?
（1）質(zhì)粒上ori序列的堿基特點(diǎn)是

A和T

A和T

比值較高，圖示胰島素基因的轉(zhuǎn)錄以

②

②

鏈作為模板。
（2）在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)最好在引物的

5′

5′

端添加限制酶

EcoRⅠ和XhoⅠ

EcoRⅠ和XhoⅠ

的識(shí)別序列，PCR反應(yīng)體系中引物的延伸需要TaqDNA聚合酶，此酶需要

Mg²⁺

Mg²⁺

（離子）的激活。
（3）生產(chǎn)過(guò)程中目的基因是利用胰島B細(xì)胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的胰島素基因，不直接使用細(xì)胞中酶切獲得的的胰島素基因原因是

胰島B細(xì)胞中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的胰島素基因中無(wú)內(nèi)含子序列。能夠在大腸桿菌中表達(dá)正確的蛋白質(zhì)

胰島B細(xì)胞中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的胰島素基因中無(wú)內(nèi)含子序列。能夠在大腸桿菌中表達(dá)正確的蛋白質(zhì)

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（4）科學(xué)家運(yùn)用大引物PCR定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)胰島素第28位氨基酸實(shí)現(xiàn)了替換，獲得了速效胰島素類(lèi)似物產(chǎn)品。相關(guān)原理如圖所示。

①第一次PCR至少需要

2

2

個(gè)循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物模板，第二次PCR應(yīng)選用大引物兩條鏈中的

B

B

（填“A”或“B”），若第二次PCR計(jì)劃循環(huán)n次，至少需要大引物

2ⁿ-1

2ⁿ-1

個(gè)。
②β-半乳糖苷酶可以分解無(wú)色的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種到添加了

氨芐青霉素和X-ga1

氨芐青霉素和X-ga1

的培養(yǎng)基上，若觀察到菌落呈現(xiàn)白色，則表明

該菌落即為含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落

該菌落即為含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落

。