果膠甲酯酶具有催化水解果膠的作用，為獲得高產(chǎn)、高純度的胞外果膠甲酯酶，如圖表示某科研小組設(shè)計的黑曲霉工程菌的構(gòu)建和發(fā)酵流程圖。

回答下列問題：
（1）科研小組從基因數(shù)據(jù)庫中獲得果膠甲酯酶基因序列后，需要根據(jù)果膠甲酯酶基因設(shè)計

引物

引物

，以擴增出大量果膠甲酯酶基因片段。利用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化，在構(gòu)建重組基因表達載體時，應(yīng)將果膠甲酯酶基因插入Ti質(zhì)粒上的

啟動子和終止子

啟動子和終止子

之間，確保侵染黑曲霉菌后能成功表達。為提高構(gòu)建重組表達載體的成功率，在構(gòu)建重組表達載體過程中加入緩沖液，其目的是

為限制酶和DNA連接酶提供適宜的pH

為限制酶和DNA連接酶提供適宜的pH

。
（2）獲得轉(zhuǎn)基因的黑曲霉后，可以通過

發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)

獲得純培養(yǎng)物，該過程需要

未改良的黑曲霉菌

未改良的黑曲霉菌

作為對照。為判斷高產(chǎn)果膠甲酯酶黑曲霉工程菌是否構(gòu)建成功，可對單位量的轉(zhuǎn)基因黑曲霉進行發(fā)酵產(chǎn)酶實驗，即通過檢測并比較轉(zhuǎn)基因黑曲霉

單位時間內(nèi)催化的果膠量

單位時間內(nèi)催化的果膠量

。因黑曲霉自身某種蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)與果膠甲酯酶相似，造成提取產(chǎn)物純度不高，可通過

基因敲除

基因敲除

，避免該蛋白產(chǎn)生，實現(xiàn)獲得高純度的果膠甲酯酶。
（3）獲得的黑曲霉工程菌需先進行活化和

擴大化

擴大化

培養(yǎng)后才能接種到發(fā)酵罐中進行大型發(fā)酵，以縮短發(fā)酵時間。發(fā)酵過程需保持

無菌、適宜溫度、營養(yǎng)供給充分

無菌、適宜溫度、營養(yǎng)供給充分

（至少寫兩點）、適宜pH、充足的氧氣等條件，保證發(fā)酵過程不受雜菌污染和菌體能正常生長。
（4）發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液進行離心處理，取

上清液

上清液

進行果膠甲酯酶的分離和純化工作。在分離過程中使用一定濃度的硫酸銨處理發(fā)酵液后獲得有活性的果膠甲酯酶沉淀物，原因是在一定濃度的硫酸銨條件下

果膠甲酯酶溶解度低且不會破壞酶結(jié)構(gòu)

果膠甲酯酶溶解度低且不會破壞酶結(jié)構(gòu)

。